Microscopische Fotografie

Microscopische Fotografie
Marc Brouwer

Microscopische Fotografie

Fotograferen op microscopisch niveau kan hele bijzondere foto's opleveren. Door de extreme vergroting is het mogelijk om details vast te leggen die voor het blote oog niet zichtbaar zijn. Er zijn talloze unieke patronen en structuren te ontdekken en ook kunnen insecten en geleedpotigen met veel meer detail vastgelegd worden dan bijvoorbeeld met een macrolens. Op deze website wil ik niet alleen foto's laten zien, maar ook een beeld geven van hoe zulke foto's gemaakt kunnen worden en wat daarbij nodig is.

Pluimmug Larve
Pluimmug Larve

Camera

Olympus E-M1 mark II
Olympus E-M1 mark II

Het beste is om een camera te gebruiken met een elektronische sluiter mogelijkheid. De meeste systeemcamera's hebben die optie, maar spiegelreflexcamera's vaak niet. In het geval van een systeemcamera met elektronische sluiter, zijn er geen mechanische onderdelen meer die voor trilling kunnen zorgen, wat erg belangrijk is bij het fotograferen op micro niveau. Sommige camera's zijn beperkt in sluitertijd bij gebruik van de elektronische sluiter waardoor het bijvoorbeeld niet mogelijk is om met een sluitertijd van 1 seconde te belichten. Dit hoeft niet erg te zijn als er genoeg verlichting op het object is. Ondersteuning voor tethering kan ook erg handig zijn om de foto's gelijk op de computer op te slaan in plaats van elke keer een geheugenkaartje te legen. Zo is het ook mogelijk om foto's al te verwerken terwijl er nog foto's gemaakt worden en verstoort het de camera opstelling minder. Zelf gebruik ik de Olympus E-M1 mark II. Deze camera heeft geen beperking op de sluitertijd van de elektronische sluiter en tethering is mogelijk met de Olympus software.

Microscopische objectieven

Met een macrolens is al veel mogelijk, zeker als deze meer vergroot dan 1:1 of als het gecombineerd wordt met tussenringen, converters of voorzetlenzen. Zolang er niet te veel onderdelen gebruikt worden, gaat dit prima, maar bij het gebruik van te veel onderdelen neemt de kwaliteit aanzienlijk af. Om toch met een extreme vergroting te werken, kan een microscopisch objectief gebruikt worden. Er zijn twee soorten objectieven te krijgen, finite objectives en infinity objectives. De meest populaire vattingen zijn voor beide RMS en M26.

Finite objectives zijn minder populair vergeleken met infinity objectives. In het kort, finite objectives werken met een vaste brandpuntsafstand en kunnen bevestigd worden op een camera door een verloopje te gebruiken van het objectief naar tussenringen en de afstand in tussenringen passend te maken met de brandpuntsafstand van het objectief. Voor de rest gaat hetzelfde op als voor infinity objectives.

microscope objectives

Infinity objectives zijn in heel veel soorten te krijgen. In prijs, kwaliteit, belichtingstechniek, vergroting en scherpstelafstand kunnen ze enorm verschillen. De vergroting die nodig is, is sterk afhankelijk van wat je wilt fotograferen. Gaat het om net dat stapje verder dan een macrolens dan is een 5x vergroting al genoeg. Om echt een stuk meer te vergroten is een vergroting van 10x of 20x wat interessanter. Hierbij is het mogelijk om veel gedetailleerde te fotograferen. 50x of meer is ook mogelijk maar maakt het fotograferen niet makkelijker. Hoe extremer de vergroting, des de minder er scherp is. De daadwerkelijke vergroting is niet alleen afhankelijk van het objectief, maar ook hoe deze bevestigd wordt op de camera.

Scherpstelafstand is belangrijk bij het fotograferen van wat grotere en diepere objecten. In de meeste gevallen is de scherpstelafstand maar een paar millimeter waardoor het onmogelijk is om bijvoorbeeld het binnenste van een bloem te fotograferen zonder deze eerst uit elkaar te halen. Ook voor insecten en andere grotere objecten is een scherpstelafstand van een paar millimeter niet voldoende. Gelukkig zijn er ook objectieve met een lange werkafstand, oftewel een grotere scherpstelafstand. Afhankelijk van de vergroting kan dit gerust een paar centimeter zijn. Hierdoor kunnen de grotere objecten goed gefotografeerd worden zonder risico van beschadigingen.

Olympus LMPLFLN 10x
Olympus LMPLFLN 10x
Objectief specificaties
  1. LMPlanFL N
  2. 10x / 0.25
  3. ∞ / - / FN26.5
  1. Objectief naam, letteraanduidingen voor werking en lenscoating
  2. Vergroting / Numerieke apertuur
  3. Infinity objective (∞) of brandpuntsafstand / Dikte van het dekglas of - als er geen dekglas nodig is / Field number

Het numerieke apertuur wordt soms gevolgd door een immersie aanduiding zoals Oil of Water. Bij het Olympus LMPLFLN objectieven is dat niet nodig en zou voor het gebruik met lange werkafstand/scherpstelafstand ook niet handig zijn. Ook het gebruik van een dekglas is niet mogelijk bij grotere objecten en dus moet het een objectief zijn waarbij een dekglas niet nodig is (aanduiding -) voor dit doeleind.

Er zijn veel belichtingstechnieken binnen microscopie en voor verschillende technieken zijn verschillende microscopische objectieven nodig. Bij het uitzoeken van een microscopisch objectief is het dus ook van belang dat deze geschikt is voor de gewenste belichting. Zo is het mogelijk om door middel van elektronen te belichten. Daar zijn speciale objectieven voor en zijn overbodig als alleen het zichtbare licht spectrum gebruikt wordt. Bij belichting met het zichtbare licht spectrum, moet het objectief geschikt zijn voor brightfield illumination. In het geval van brightfield illumination zijn er ook nog verschillende technieken, waarvan de meest bekende technieken reflecterend en doorschijnend zijn en kunnen gecombineerd worden. Bij reflecterend is de lichtbron boven het object, dat wil zeggen, aan dezelfde kant als de camera. Het licht schijnt op het object en komt dus als reflecterend licht door de lens. In het geval van doorschijnend belichten is de lichtbron achter het object, dus tegenover de camera en schijnt door het object heen en door naar de lens. Reflecterend is eigenlijk altijd mogelijk, maar doorschijnend niet, omdat er niet altijd licht door een object heen gaat. Om de achtergrond zwart te krijgen bij reflecterend licht moet het object op een objectglaasje liggen en alles onder het glaasje afgeschermd worden zodat daar geen licht komt.

Doorschijnende belichting
Doorschijnende belichting
Reflecterende belichting
Reflecterende belichting

Bevestiging

Een infinity objective kan op twee manieren bevestigd worden op een camera. De eerste optie is om het microscopisch objectief voorop een camera objectief te bevestiging. Hierbij is een adapterring nodig om de vatting van het microscopisch objectief om te zetten naar een filtermaat voor op de lens. Een voorbeeld is een RMS naar 62mm adapterring, als het microscopisch objectief een RMS vatting heeft en op een camera objectief met filtermaat 62mm bevestigd moet worden. Vervolgens moet het camera objectief op handmatige scherpstelling staan, met scherpstelling op oneindig (∞). Per camera kan het verschillen welk camera objectief een beeldvullend resultaat geeft, maar veelal is een teleobjectief nodig. Na het afstellen kan een object voor het objectief geplaatst worden op een afstand van enkele millimeters tot een paar centimeters (afhankelijk van het microscopisch objectief) en kan het fotograferen beginnen.

Infinity objective on telephoto lens

Optie 2 is wellicht iets ingewikkelder, maar kan voor een mooier resultaat zorgen omdat er minder glas bij gebruikt wordt. In plaats van een camera objectief, waar veel glas elementen inzitten, wordt er maar 1 zogeheten tube lens gebruikt. Deze tube lens zorgt ervoor dat het licht, net als bij een camera objectief, goed op de sensor geprojecteerd wordt. Er bestaan speciale tube lenzen, maar een goed alternatief is een Raynox voorzetlens, bijvoorbeeld de Raynox DCR-250. Zowel de Raynox DCR-250 als de Raynox DCR-150 kunnen gebruikt worden, maar de DCR-150 vergroot meer dan DCR-250. Dit is in tegenstelling tot hun vergroting bij macro fotografie omdat dan de DCR-250 meer vergroot.

Components
  1. Tussenringen
  2. 52mm - 43mm adapter ring
  3. Raynox DCR-250 (tube lens)
  4. 49mm - RMS adapter ring
  5. Olympus LMPLFLN 10x (microscopisch objectief)
Tussenringen, Raynox DCR-250, Olympus LMPLFLN 10x
  1. Tussenringen
  2. Raynox DCR-250 (tube lens)
  3. Olympus LMPLFLN 10x (microscopisch objectief)

De bevestiging van tussenringen naar Raynox en vervolgens naar een microscopisch objectief is in beide gevallen hetzelfde. Er is een verloop nodig van de tussenringen naar 43mm (Raynox diameter). In mijn geval is het een 52mm naar 43mm adapterring, maar dit is afhankelijk van de tussenringen. In sommige gevallen kan het handig zijn om een T2 of M42 adapter te gebruiken en vanaf de adapter een adapterring te gebruiken naar 43mm. Aan de voorkant heeft de Raynox voorzetlens een 49mm filtermaat en in combinatie met een microscopisch objectief met een RMS vatting, betekent dit dat een 49mm naar RMS adapterring nodig is om het microscopisch objectief op de Raynox te bevestigen.

Hoeveel millimeter er aan tussenringen nodig is verschilt per camera mount en per Raynox lens. Om het een stukje makkelijker te maken heb ik een tooltje gemaakt die het voor je berekent. Selecteer je camera mount en welke Raynox je wilt gebruiken en het aantal millimeters tussenringen wordt berekent. Als het goed afgesteld is zul je een (bijna) scherp beeld zien als je alleen de tussenringen en Raynox lens voor je camera hebt. Op deze manier kun je dus controleren dat de Raynox lens op de juiste afstand van de sensor staat. Als het met normale tussenringen niet goed af te stellen is, dan bestaan er ook variabele tussenringen om het op de millimeter nauwkeurig af te stellen.

Bereken benodigde tussenringen

- mm

Macro rail/opstelling

Microscopische objectieven hebben slechts een heel klein scherptevlak (het gaat om een aantal micron...). Om een object als nog van voor tot achter scherp te krijgen moet het object in laagjes gefotografeerd worden. Elke laagje heeft steeds een ander klein deel van het object scherp. Al deze laagjes worden later samengevoegd tot een scherp geheel. Deze techniek heet focus stacking, meer over deze techniek leg ik verderop uit. Eerst het fotograferen van al deze laagjes.

macrorail
threaded shaft
LED lights

Afhankelijk van het formaat van het object dat gefotografeerd wordt, kan het zijn dat er een aantal honderd tot enkele duizenden foto's nodig zijn om al de eerder genoemde laagjes te fotograferen. De verschuiving in scherptevlak tussen twee foto's is veelal een aantal micron. Het grote aantal foto's en de extreem kleine verschuiving is handmatig niet meer te doen. Hiervoor is een geautomatiseerde macro rail nodig. Deze is in staat om te camera steeds die paar micron te verplaatsen en stuurt de camera aan om foto's te maken. Geautomatiseerde macro rails zijn te koop, maar het is ook mogelijk om ze zelf te maken. De macro rail die ik zelf gemaakt heb is opgebouwd uit onderdelen van Makeblock, met een microcontroller gebaseerd op de Arduino UNO.

Essentiële onderdelen:
  • Microcontroller
  • Stappenmotor
  • Schroefdraadstang
  • Camera aansturingsonderdeel
  • Lineaire as(sen)
  • Bevestigingsbalken
Optionele onderdelen:
  • LED lampen
  • Bluetooth onderdeel
  • Snelkoppelingsklem
  • Snelkoppelingsplaten

De combinatie van de stappenmotor en de schroefdraadstang bepalen hoe nauwkeurig de camera verschoven kan worden. De schroefdraadstang bepaalde de afstand per rotatie van 360°, dus de afstand door de schroef een keer helemaal rond te draaien. Voor mijn schroefdraadstang is dit 2mm per 360°. De stapgrote in graden van de stappenmotor bepaald hoeveel de schroefdraadstang rondgedraaid kan worden. Mijn stappenmotor heeft een stapgrote van 1.8° per volledige stap, maar het is mogelijk om als minimum 1/16e van deze stap per keer de draaien. Hierdoor is de minimale rotatie van de stappenmotor 1.8°/16 = 0.1125°. Voor een volledige rotatie van 360°, met een stapgrote van 0.1125°, zijn er dus 360°/0.1125° = 3200 stappen nodig om 360° te roteren. De verschuiving per stap is nu 2mm/3200 = 0.000625mm = 0.625µm. Dus de nauwkeurigheid van mijn macro rail is 0.625µm per stap.

Het proces van de macro rail is verder heel eenvoudig. Vanaf het startpunt tot het eindpunt is het herhaaldelijk de camera verschuiven, LED lampen aanzetten, foto maken, LED lampen uitzetten en weer opnieuw. Na het verschuiven van de camera kan het handig zijn om even te wachten voor het maken van de foto om trillingen te voorkomen. Het aan en uitzetten van de LED lampen is niet altijd nodig.

Focus Stacking

Before Focus Stacking
After Focus Stacking

Focus stacking is een techniek om meer scherp te krijgen dan met een foto mogelijk is. Dit wordt gedaan door meerder foto's te combineren. Elke foto heeft een klein deel van een object scherp en door al deze foto's samen te voegen is het mogelijk om een scherp geheel te krijgen. Hoe deze foto's gemaakt kunnen worden staat beschreven onder het kopje macro rail/opstelling. Het beste programma dat ik tot nu toe tegengekomen ben is Zerene Stacker. Het programma kent verschillende methoden om te stacken en lijnt foto's uit op het moment dat ze iets verschoven zijn. Alleen bij diepe stacks van duizend foto's of meer is er een zichtbaar verlies in scherpte. In de toekomst wil ik zelf stacking software schrijven die dit beter kan, hier ben ik wel aan begonnen, maar gezien de hoeveelheid tijd dat het vraagt kan dit nog even duren. Belangrijk bij focus stacking is wel dat het object zelf niet beweegt aangezien dit niet gecorrigeerd kan worden. Ook moeten de scherpe delen in elkaar overlopen om onscherpe delen te voorkomen.

Stitching

Stitching kan gezien worden als een soort panorama. Als een object niet volledig in beeld past moet het in delen gefotografeerd worden. Elk deel is hier een foto waarbij eerst focus stacking toegepast is om het object van voor tot achter scherp te krijgen. Nadat alle delen gestackt zijn kunnen ze als een puzzel samengevoegd worden tot een foto, dit samenvoegen heet stitching. Als er genoeg overlap is kan een programma als Photoshop dit door middel van de panorama functie samenvoegen. Lukt dit niet dan moet het handmatig gedaan worden. Bij het handmatig uitlijnen is het vaak makkelijk om in lagen te werken en een de bovenste laag half doorzichtig te maken. Vervolgens kunnen de lagen over elkaar gelegd worden zodat er een minimaal verschil is. Daarna is het met een masker (of door te gummen) mogelijk om het harde verloop tussen twee lagen weg te krijgen en de lagen vloeiend in elkaar over te laten lopen.

stitch segment
stitch segment
stitch segment
stitch segment
stitched photo

Fotograaf

Naam:Marc Brouwer
Leeftijd:25
Huidige Studie:Master Computer Science and Engineering,
Technische Universiteit Eindhoven
Werk:Parttimer bij CameraNU.nl
Eigenaar van Theta 1 Software
Meer Foto's:
Marc Brouwer

Contact

Heb je een vraag, een opmerking, feedback of suggesties voor toevoegingen of verbeteringen? Laat het mij gerust weten!

10 + 4 =